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瓊脂糖凝膠電泳步驟

發布時間:2018/6/21

    文章關鍵詞:瓊脂糖,瓊脂,凝膠電泳,步驟

 

    電泳中有一種利用瓊脂糖作為介質的方法,稱為瓊脂糖凝膠電泳。它的分析原理與其他支持物電泳有一些區別,主要表現在它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。那瓊脂糖凝膠電泳的步驟是什么呢?下面青德慧海洋生物為您介紹一下。

 

    一、試劑配制

    5×TBE緩沖液:450 mmol/L Tris-硼酸,10 mmol/L EDTA,pH值8.0。在使用時,先將上述儲存液稀釋10倍,達到0.5×TBE緩沖液后,就能同時作為電泳和制膠用的緩沖液。


    二、制膠


    1.  根椐需要的制膠量和凝膠濃度,在已有電泳緩沖液的三角錐瓶中,投入準確稱量的瓊脂糖粉(總液體量保持不超過錐瓶的50%容量)。瓊脂糖粉末和0.5×TBE buffer的比例(w:v)參考下表,常用瓊脂糖濃度為0.7-1%。

 

 瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍

瓊脂糖濃度

最佳線形DNA分辨范圍(bp)

0.50%

 1 000~30 000

0.7%  

800~12 000

1%

500~10 000

1.20%

400~7 000

1.50%

200~3 000

2%

50~2 000

2%~5%

20~1 000

 



    2.  將保鮮膜或牛皮紙覆蓋在錐瓶的瓶口,并使用牙簽或細針在覆紙上扎些小孔,然后放入微波爐,將瓊脂糖加熱溶解。當溶液加熱至沸騰后,需要搖動錐瓶,使瓊脂糖充分且均勻溶解。操作這一步時,注意戴上防熱手套,以防燙傷。多次搖晃,直到瓊脂糖完全溶解。

    3.  常溫放置,在溶液冷卻至50℃-60℃左右時,根據需要決定是否加入溴化乙錠溶液(終濃度0.5  μg/ml)或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料,并且充分混勻。


    4.  將瓊脂糖溶液倒入制膠模具中,挑選適當位置,插入梳子,凝膠厚度保持在3~5 mm之間。制膠模如下圖所示,小膠倒入25-30 mL上下瓊脂糖溶液,大膠則60-70 mL上下,如果需切膠回收,凝膠可以選擇適當加厚。

    5.  在室溫下使膠凝固,大約需要30——60分鐘。

 


    三、上樣


    1.  取合適份量的樣品與6×上樣緩沖液混勻(如:1 μl樣品與5 μl 6×上樣緩沖液),用微量移液槍謹慎加入樣品槽中。


    2.  上樣量可以根據樣品的濃度適當調整范圍,如果DNA含量較低,可以按照上面說的比例增加上樣量,但是總體積不能超過樣品槽容量(一般小孔40 μl 為上限,大孔200 μl 為上限,具體與制膠膜規格相關)。

 

    3.  注意,每一個樣品都要使用不同槍頭,以防止發生污染,注意上樣時要謹慎操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。

    四、電泳

    1.  加樣完成后,合上電泳槽蓋并立即接通電源。電壓控制在110 V,電流在40 mA以上。

    2.  當條帶移動到距凝膠前沿約2厘米時(約40分鐘),停止電泳。

    3.  紫外線照射下拍照并觀察。

 

    以上就是瓊脂糖凝膠電泳的詳細步驟,大家按照步驟,就可順利實現操作,達成實驗目的。

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